高效液相色譜根據壓力等級可分為3類：正相高效液相色譜儀（耐壓5000-6000psi）、反相高效液相色譜儀（耐壓9000-10000psi）和超高效液相色譜儀(超高效液相色譜儀)（耐壓12000，甚至達到15000psi以上）。

1，正相高效液相色譜儀

這并不是常用的高效液相色譜方法。正相高效液相使用非極性溶劑作為流動相，硅膠顆粒作為固定相。在常規高效液相色譜儀中，與非極性化合物相比，極性化合物在固定相中會更長時間地粘附在極性有機硅上。因此，非極性化合物在正常高效液相色譜儀中的洗脫速度更快。孔徑一般在3微米左右。

正相色譜法技術原理： 采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三*甲烷等以調節組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。

2，反相高效液相色譜儀

這是常見的高效液相色譜類型。在反相高效液相中，固定相被烴鏈（通常長 8-18 個碳）改性，導致色譜柱變為非極性。也使用極性溶劑。在反相高效液相色譜儀中，樣品中的極性分子會與溶劑產生強烈的吸引力，從而使它們更快地洗脫。它們也不會與非極性固定相相互作用。非極性化合物會與固定相產生范德華力和分散相互作用，因此它們的洗脫速度較慢。

反相色譜法技術原理： 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用更為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。

3，超高效液相色譜儀

這類高效液相色譜運行速度更快、使用的溶劑更少且分辨率更高。色譜柱也更小，固定相顆粒的尺寸要小得多。較小的孔（亞 2 微米）促進了分子更好的分離和分辨率。較短的色譜柱還可以進行快速檢測。然而，超高效液相色譜不能用于干燥或未過濾的樣品，因為較小的孔會堵塞，這是一個昂貴且耗時的修復過程。

填料材料的新進展已經開始在高效液相色譜儀和超高效液相色譜儀之間創建中間解決方案。核殼顆粒是目前市場上的一種此類填充材料。使用核殼顆粒的效率與使用亞 2 微米顆粒的效率相同，但可以在低得多的壓力下運行。甚至有人猜測這些效率可以在標準高效液相色譜儀機器上產生。

高效液相色譜機器通常包含一個紫外線檢測器來測量樣品中分子發出的紫外線。但是，某些高效液相色譜儀機器可以與質譜儀 (MS) 結合使用。使用 HPLC-MS 時，可以通過 m/z 比來識別分子，而無需知道保留時間。